啤酒生产中常见病菌与检验

目录

啤酒生产中常见病害微生物及其特征

为了把污染的风险降至最小，我们应该定期取样检查，以确定在某个环节是否感染，如果感染可以立即采取措施，并且善于总结经验，有助于提高。

有害微生物污染对啤酒发酵和产品质量的影响
种类（属）	对发酵的影响	对产品质量的影响
		浑浊度	粘度	风味
野生酵母	过高的发酵度	+	-	酯味、酚味、杂醇油高、双乙酰高、硫化氢味
乳酸菌或片球菌	-	+	-	乳酸、醋酸、双乙酰、丙酮
醋酸菌或氧化葡萄糖杆菌	-	+①	+①	乙酸
肠杆菌	延缓发酵，形成亚硝基化合物	-	-	二甲基硫化合物、乙醛、杂醇油、乙酸、酚类化合物、连二酮
发酵单胞菌	-	+②	-	硫化氢、乙醛
梳状菌	-	+	-	硫化氢、甲硫醇、乙酸、乳酸、丙酸、丁二酸、乙偶姻
巨球形菌	-	+	-	硫化氢、丁酸、戊酸、己酸、乙酸乙偶姻
月形单胞菌	-	+	-	乙酸、乳酸、丙酸
嗜发酵菌	-	+③	-	乙酸、丙酸
梭状芽孢杆菌	-	-	-	丁酸、戊酸、己酸、丙酸

注：①表示有氧存在时；②表示在未成熟啤酒中；③表示在pH值5~6时。

杂菌的来源与主要污染途径

杂菌的来源

• 空气

啤酒生产过程中，目前传统方法大都是开放操作，物料经常与空气直接接触，如果空气不干净，容易染菌。扩培中的酵母由于自酿的设备极其简陋，有可能只是一个三角瓶配合棉花，这时候如果环境中的空气不干净，则很容易污染扩培中的酵母。又如，在麦汁冷却后需要通入氧气以供酵母呼吸，如果通入的空气不干净，是极为容易染菌的。因此，环境卫生和无菌供氧是非常重要的。

• 水

由于生产中用水几乎在每个环节，尤其是在酵母活化和扩培的环节的用水，直接影响到酵母的健康，所以水的无菌处理是非常重要的。

• 原料

原料会带入一部分杂菌，但是在煮沸环节中，这些杂菌几乎已经被杀灭（干投、直接添加等除外），所以原料中的杂菌并不是十分危险。

• 设备和管路

直接与麦汁接触的设备和管路如果不干净，极易染菌，尤其是看不见的部分（如阀门、弯头）更要彻底灭菌。

主要污染途径

啤酒有害菌的划分与分类

按生理学类型分类

啤酒厂的病害生物，主要包括下列三方面：细菌、野生酵母和霉菌。

• 严格需氧菌

它在生长过程中，必须有氧的存在，否则不能声张。霉菌是典型的需氧菌。

• 微需氧菌

它在微量含氧情况下能生存。醋酸杆菌和醋酸单胞菌属于此类。

• 兼性厌氧菌

在有氧或无氧环境下都能生存，酵母属于此类。

• 绝对厌氧菌

在有氧环境下不能生存，如短螺状菌、啤酒巨型球菌。

啤酒厂的病害生物，主要是各种野生酵母和某些属的细菌。它们均属于微需氧菌和兼性厌氧菌。霉菌和放线菌在麦汁（酸性）和啤酒（厌氧）的条件下很难生长繁殖。但是啤酒的生产环境却经常污染霉菌，应该引起足够的重视。

按对啤酒的有害程度分类

可以把啤酒有害菌分为五个等级，它们能够对啤酒的口味和气味产生损害，或通过形成浑浊、沉淀使啤酒外观发生变化。

• 专性啤酒有害菌

对啤酒质量稳定性的影响最大，它们在啤酒低温、厌氧、低PH值、含有酒花苦味物质和酒精以及缺乏营养物质的不利环境下，仍然能很好地生长，并且不需要较长的适应期。

• 潜在啤酒有害菌

只有在一定的条件下，潜在啤酒有害菌才能在啤酒中生长并造成危害，如啤酒PH值偏高、酒花的苦味物质太低、发酵度不高、含氧量高、酒精含量较低。某些微生物经过较长的适应期后才会表现出啤酒有害菌的特征，它们也属于潜在啤酒有害菌。生产中要注意这类微生物，采取措施控制其数量，不允许它们在生产中长时间存在。否则，它们会逐渐适应啤酒的特殊环境。

• 间接啤酒有害菌

一般出现在酵母接种和发酵的起始阶段，对啤酒不会产生直接损害。但是在一定条件下，它们仍能在啤酒生产过程中繁殖，产生影响啤酒口味的前驱物质，并最终对成品啤酒的质量造成不良影响。

• 指示性微生物

虽然它们对啤酒的生物稳定性不会产生危害，但当它们出现时，往往会伴随着啤酒有害菌的出现，其特点是比较容易被检查出来。当清洗和灭菌措施有缺陷，或者当生产过程出现问题时，指示性微生物就会出现。按照实际经验，如果指示性微生物一旦出现，应该迅速采取相应措施，防止微生物状况继续恶化。

• 潜伏微生物

这些微生物只是偶然和无规律地出现，通过不同的途径侵入生产过程直至成品啤酒中。该类微生物造成的染菌，持续时间是短暂的，染菌的主要原因是由于生产用水染菌以及现场进行建筑维修等。它们通常是自然界广泛存在的微生物，在食品生产企业导出能发现。与其他微生物相比，区别在于其强壮的菌体细胞能在啤酒中存活，用一般传统培养方法就可以把它们检查出来。

啤酒有害菌等级
等级	能否在啤酒中生长	经适应后能否在啤酒中生长	能否在抑菌能力降低的啤酒中生长	能否在非专门培养基中检测到（如麦汁培琼脂养基）	举例	对啤酒的影响及作用
专性啤酒有害菌	能	能	能	不能/能	乳酸杆菌 四联球菌 果胶杆菌 酿酒酵母	浑浊/酸败 沉淀/双乙酰过高 浑浊/丙酸、乙偶姻过高 沉淀/浑浊
潜在啤酒有害菌	不能	能/不能	能/不能	能/不能	乳酸杆菌 链球菌 微球菌 发酵单胞菌 巴氏酵母	轻度浑浊/双乙酰过高 轻度浑浊/双乙酰过高 异香/轻微沉淀 浑浊/H2S/DMS/乙醛口味缺陷 口味变化/浑浊
间接啤酒有害菌	不能	不能	不能/能	能	肠杆菌 变形杆菌 假丝酵母 汉逊酵母 酿酒酵母	苯酚味/DMS/乙偶姻/蛋白酶 苯酚味/DMS/蛋白酶 口味缺陷（挥发性苯酚味） 口味缺陷（乙酸乙酯） 造成发酵缺陷
指示性微生物	不能	不能	不能	能	醋酸杆菌 不动细菌 克莱伯氏菌 德巴利氏酵母 酿酒酵母	经常与啤酒有害菌相伴
潜伏微生物	不能	不能	不能	能	芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌 肠杆菌 微球菌	能在啤酒中长时间潜伏存活

有害细菌

在整个酿造过程中，由于操作不慎或卫生条件不利，细菌污染随时都可发生。麦汁中虽然含有一定防腐能力的酒花树脂，对革兰阳性菌较敏感，但有些细菌对酒花树脂会出现习惯性耐受，因而仍不免有污染。发酵后期的啤酒，含有4%左右的酒精和较多的二氧化碳，并且处在厌氧状态（溶解氧＜0.03mg/L）以及低温、低PH值条件下，对细菌生长是不利的，但仍然难免有某些厌氧菌和微需氧菌污染。

啤酒厂中的啤酒有害菌主要有乳酸杆菌、四联球菌、果胶杆菌以及足球菌等，所占比例依次约为65%、28%、0.05%、0.02%，它们均能使酒体形成浑浊和沉淀，造成啤酒酸败，导致口味异常、口感变差。

革兰阳性菌

• 巴氏乳酸菌

这是啤酒中常见的一种杂菌，通常为长杆状（0.5~1.0）μm×（5~120）μm，形态多变，有时在麦汁中为短杆状，而在啤酒中为长杆状，细胞常连接成钝角形，不运动。该菌一般从大麦或麦芽中带入，如果啤酒受其侵害，即形成沉淀，摇动时便出现丝光样浑浊，并使啤酒产生酸味，这被认为是该菌的特征。在酵母琼脂培养基上，菌落边缘光滑，培养120~144h后即布满整个培养皿，在麦汁明胶上呈树枝状灰白色隆起，3%酒糟能促使发育，10%酒精即抑制其生长。营异型乳酸发酵，能发酵阿戊糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、棉籽糖、海藻糖和甘露糖，形成乳酸、乙酸以及二氧化碳，不还原硝酸盐。属于兼性厌氧菌，最适温度30℃，最适ph4~5，不抗热，0.15PU值左右可以致死。在淡色啤酒中，该菌生长较好；在黑色啤酒中，由于含有焦糖物质，其生长受到一定的限制。酒花树脂不能抑制其生长，但利用巴氏灭菌法能将其杀灭。在啤酒厂中，降低麦汁的ph值，同时使成品啤酒中残余的可发酵物质尽量减少至最低限度，并纯化酵母菌种，是防止该菌污染的较好措施。

• 四联球菌

球形很小，0.8~1.0μm直径，排列成对，也有单个的，在酸性培养基中趋向四联，在中性培养基中呈双球状，不运动。革兰阳性，荚膜染色可见到细胞周围有一层明显的圆形荚膜。买至培养基上菌落小，2~3mm，圆形凸起，光滑，边缘整齐。穿刺培养沿穿刺线生长，表面生长微弱，马铃薯上很少生长，在加油碳酸钙的麦汁培养基上，菌落周围形成透明圈，能使麦汁浑浊，产生沉淀，在肉汤琼脂上生长不良。能发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、阿戊糖，不发酵菊芋糖、糊精、淀粉，能产生双乙酰，不分解尿素。最适生长温度18~25℃，30℃以上不易生长，最适PH5.8，超过7.1不能生长，不抗热，2PU值可以致死。啤酒一经四联球菌污染，即表现发酸、变味、浑浊、甚至粘稠，使啤酒不能饮用。这是啤酒危害最大的一种病害微生物，多发生在下面发酵啤酒中（国内有家啤酒厂由于污染此菌，曾被迫停产3年）。四联球菌在微量二氧化碳存在下能很好地繁殖，如酒精含量1%~8%能刺激其生长，最适浓度为3%。在黑啤酒中比淡啤酒中生长迅速。如在PH5以下，由乙酰甲基甲醇产生双乙酰。

革兰阴性菌

• 变形黄杆菌

该菌是啤酒发酵时的好氧性污染菌，一般常在啤酒的发酵初期出现，形态多变，在麦芽中常常形成肥杆状。（0.8~1.2）μm~（1.5~4.0）μm，单个或成链状，不运动。在麦汁琼脂中形成一种黄色到橙黄色的色素，不产生孢子。能同化多种单糖和双糖，对加酒花或不加酒花的麦汁能产生少量挥发酸、不会发酸、双乙酰、痕迹酒精，并释放氢和二氧化碳。为兼性厌氧菌，在麦汁中生长最适温度为32℃，最适PH5.0，发酵初期生长很快，但在PH4.4以下，48h后便停止生长。很少有啤酒厂不污染此菌，酵母发酵不旺盛时，此菌发展较快，能使啤酒产生轻微的胡萝卜味。种酵母中常染此菌，浓度可达0.1%~10.0%。因为此菌在ph4.4以下即不能声张，故危害尚不严重，但发酵起发慢，能产明显的欧洲防风味道（胡萝卜味？反正是不好的气味），防止的办法就是让麦汁很快起发，发酵旺盛，PH值很快下降。该菌常常在上面发酵的酵母泥中找到。

• 大肠杆菌群

在较高的温度下能生长，世代时间极短，并能使麦汁产生芹菜味。在适宜的环境下，特别是在麦汁管路及冷却麦汁管路滞留区，或停工期间，这种细菌能很快地繁殖。生产时麦汁流经此处，便被感染至发酵罐中。即使该菌到达发酵罐后立即停止生长，其芹菜味也损害了啤酒的风味。所以，做好麦汁冷却段管路及设备清洁工作，是预防该菌污染啤酒的最好措施。

• 醋酸杆菌属

粗壮杆菌，（0.4~0.8）μm~（1.0~2.0）μm，细胞单独、成对或链状生长，有的菌株运动，运动性易变，运动菌株周生鞭毛。在啤酒中生长集中在液面，形成强的纤维菌膜，不生孢子，一般为短杆状，有的菌株在麦汁和啤酒中呈球状。好氧或微好氧性菌，适应广泛PH值，最适温度30℃，对酒花树脂不敏感，耐酸，能同化葡萄糖、乙醇、丙醇、乙二醇等产生乙酸，具有柠檬酸循环的酶，能进一步氧化乙酸为二氧化碳和水，酒精含量达8%~10%时受到抑制，能氧化乳酸钙为碳酸钙。能使啤酒浑浊、变味、发黏。

• 醋酸单胞菌属

粗壮杆菌，（0.4~0.9）μm×（1.0~2.0）μm，细胞单独、成对或链状生长，一般都运动，极生鞭毛。液体培养形成菌膜，不生孢子，一般为短杆状，有的菌株在麦汁和啤酒中呈球状。好氧或微好氧菌，有时菌株在绝氧条件下也能生长、最适生长温度为30℃，对酒花树脂不敏感，耐酸，能同化葡萄糖、乙醇、丙醇、乙二醇等产生乙酸，有限的氧化能力，只能氧化乙醇乙酸，具有柠檬酸循环的酶，不能氧化乳酸钙为碳酸钙，酒精含量6%以上时受到抑制。啤酒厂最危险的黏败酶，能使啤酒变浑浊、变味、发黏。

• 发酵单胞菌

原名嫌气五色杆菌，中等长度粗壮菌（1~1.5）μm×（2~3）μm，有时分散呈玫瑰花瓣状，幼细胞具有运动性，丛鞭毛，在啤酒中不运动。在麦汁中，即使酒花率高，PH4.0以下也能生长。无糖啤酒中不能生长，葡萄糖啤酒明胶培养基穿刺培养，沿穿刺线成浓密的念珠状，在培养基表面不生长，2%葡萄糖啤酒培养液中成浓密的浑浊物，最后形成大量沉淀，液清。不发酵糊精、麦芽糖、乳糖，但是能微弱发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，生成微量酒精和二氧化碳。生长ph为2.5~7.5，最适温度30℃，不还原硝酸盐，不形成乙酰甲基、甲醇及双乙酰，不液化明胶，不产生吲哚，不抗热，2.0PU值可以致死，耐酒精含量6%，8%的酒精含量可以完全抑制其生长。该菌为啤酒工业中非常危险的杂菌之一，啤酒感染后，兼有野生酵母及细菌感染最恶劣的缺点，但一般很少见。它有抵抗酒花的防腐能力，在酒花用量很高的啤酒中，甚至ph4.0以下，也能很快繁殖，能耐受高氢离子浓度，排除空气反而促使其发育。该菌还能使啤酒变成类似巴氏乳酸杆菌产生的浑浊物一样，形成浓密的丝状，但略少光泽，啤酒的香气被其破坏，气味极不好，兼有硫化氢臭气和苹果的香气，并有大量气体生成。它对葡萄糖的作用像酵母一样，能产生酒精和二氧化碳，在啤酒中常以星状的群体出现，不形成孢子。60℃5min即可被杀灭。

• 大肠菌群

主要包括：克氏杆菌属，埃希杆菌属。短杆菌（0.5~0.8）μm×（1~2）μm，不运动，不形成孢子。兼性厌氧菌，在猪胆盐存在时，培养在乳糖中，37℃、48h内产酸产气，最适合ph5.0~7.5，ph4.0以下既不生长，通过不同代谢途径，能分解葡萄糖，产生乳酸、乙酸、乙醇、二氧化碳和氢，在上述反应中，埃希杆菌生成等量的二氧化碳和氢，克氏杆菌则生成多量的二氧化碳、较少的乳酸和乙酸。此类菌的污染来源为土壤和水，在麦汁中生长很快，产生异味，危害甚大，在啤酒中因ph低，不易生长，麦汁冷却到1.7℃以下可以抑制其生长。防止的主要办法是麦汁及时接种酵母，不要延误时间。

主要的野生酵母

野生酵母是指不为啤酒正常生产所用，在啤酒酿造过程中，容易引起不正常发酵或者产生病害的异种酵母。有的野生酵母在啤酒生产中可引起严重污染，但不是所有的野生酵母都对啤酒有害。有的野生酵母对这一类啤酒可能是无害的，但是对另一类啤酒则可能是有害的，如酒香酵母属能赋予上面发酵蓝比克啤酒特殊风味，但对下面发酵啤酒来说，能引起异味，就是有害的了。

常见的野生酵母种类

酵母属中的非培养酵母。

其他酵母属如克氏酵母属、汉逊酵母属、假蝗酵母属、毕赤酵母属、圆酵母属、红酵母属、酒香酵母属等。

啤酒厂主要病害野生酵母菌的名称和特征

• 啤酒酵母浑浊变种

有假菌丝，卵形、椭圆形，有时腊肠形，大小为（2.5~8.0）μm×（5~12）μm；形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.5~5μm，25~30℃，40h内形成；在液体培养基中可形成菌膜，在13~15℃、8~10天形成，26~28℃、4~5天形成；在琼脂斜面培养，菌落呈淡黄色，软质，润湿，光滑，边缘为锯齿状，能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖1/3棉籽糖；上面发酵，不能同化硝酸盐，以乙醇为碳源，发育良好；能引起啤酒浑浊及刺鼻难闻的气味，在上面发酵啤酒中经常遇到。

• 巴氏酵母

有假菌丝，长卵圆形或腊肠形（2.5~4.0）μm×（7.0~26.0）微米。形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.4~5μm，25~30℃，40h内形成。琼脂斜面培养，菌落呈白色，润湿，光滑，边缘弯曲。在液体培养基中可形成薄的菌膜，在13~15℃、15~30天形成，26~28℃、7~10天形成。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、2/3棉籽糖；下面发酵，不能同化硝酸盐，能稍微同化乙醇。是下面发酵啤酒中危害较大的菌，引起浑浊，妨碍酒液澄清，产生令人厌恶的苦味及不愉快气味。

• 魏氏酵母

有假菌丝，长卵圆形，（4~8）μm×（9~18）μm，球形，滑面，形成孢子最适温度34℃，11h内形成。琼脂斜面培养，菌落软泥状，有光泽，稍皱，边缘弯曲。在液体培养基中可形成薄的菌膜。能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。

• 强壮酵母

有假菌丝，细胞伸长成腊肠形，（2~3）μm×（9~10）μm。形成孢子圆形，滑面，1~4个孢子，1.5~5μm，25~30℃，40h内形成。琼脂斜面培养，菌落呈淡黄色，软质，润湿，光滑，波纹状，边缘为锯齿状，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。在液体培养基中可形成菌膜，在13~15℃、10~15天形成；26~28℃、7~10天形成。下面发酵，以乙醇为碳源，发育良好。能使啤酒产生浑浊，危害较大。

• 糖化酵母

无假菌丝，圆形或椭圆形，（3~7）μm~（4~10）μm，能形成孢子，在液体培养基中不形成菌膜，能发酵糊精，使啤酒的发酵度异常高。使啤酒产生浑浊，酒味淡薄并形成异味。

• 柠檬形克氏酵母

无假菌丝，柠檬形的长椭圆或短椭圆形，（2~4.5）μm×（5~8）微米，不能形成孢子，在液体培养基中有时形成薄菌膜，能发酵葡萄糖，可使啤酒形成异味。

• 异常汉逊酵母

有假菌丝，圆形或椭圆形（2~5）μm×（4.5~10）微米。形成孢子，草帽状、角状，1~4个。琼脂斜面培养，菌落乳白色，无光泽，平摊，边缘丝状。在液体培养基中可形成菌膜，25℃、3天液面有白色菌膜。能发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。能同化乙醇、硝酸盐，在空气存在下生长很快。

• 菌膜假丝酵母

有假菌丝，卵圆形或圆筒形，有时伸长，（3~4.5）μm×（4.5~10）μm，不形成孢子。菌落呈灰色，软质平滑，中央略高，边缘透明有细微皱纹。在液体培养基中可形成鲜黄色菌膜，初平滑，后变为褶皱。能发酵葡萄糖。在空气存在下，氧化乙醇，能同化葡萄糖、果糖、有机酸。使啤酒浑浊并产生不良气味。

• 膜醭毕赤酵母

有假菌丝，圆形、圆柱或椭圆形，（3~5）μm×（5~12）μm。形成孢子，球形、半圆形，1~4个。琼脂斜面培养，菌落乳白色或白色。在液体培养基中可形成白色干燥菌膜。能发酵葡萄糖。在空气存在下，能氧化乙醇，生长很快，使啤酒浑浊并产生异味。

• 球拟圆酵母

无假菌丝，圆形或椭圆形，（3.5~5.5）μm×（4~6.5）μm，不形成孢子。在液体培养基中不形成菌膜。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖。属于耗氧酵母，若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。

• 平常球拟圆酵母

无假菌丝，卵圆形，（2~3.5）μm×（3~6）μm，不形成孢子。在液体培养基中偶尔形成薄菌膜。能发酵葡萄糖。若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。

• 胶红酵母

无假菌丝，卵圆形，（2.5~5）μm×（4~7）μm，不形成孢子。在液体培养基中不形成菌膜。若不暴露于空气中，对啤酒的危害可小一些。

• 布鲁塞尔酒香酵母

有假菌丝，卵圆形，（2.5~4）μm×（3~9）μm，不形成孢子。在液体培养基中形成薄菌膜，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖，能同化硝酸盐。对蓝比克上面啤酒是必需的。

生产阶段中的杂菌污染

糖化

适热乳酸菌：醪液保温50℃以下，容易感染适热乳酸菌，如载氏乳酸菌，产生乳酸菌，对降低醪液ph有利。50℃以上，此菌不易生长，因此不易染菌。

麦汁冷却至接种

• 大肠菌群

此类菌在40℃仍可生长，应该防止不洁的水混入麦汁中，此类菌繁殖极快，7h内可繁殖几百万倍，感染少量菌即铸成大害。并且不易消灭，连续发酵所使用的间歇麦汁更应注意避免污染此菌。

• 野生酵母

野生酵母常潜伏在管道的缝隙里、管子的接头螺纹上、入孔的垫料上等，当麦汁流经管道进入发酵罐中，着一些部位都是污染野生酵母的媒介。此外，也有由重复使用的种酵母中带入的可能。

• 醋酸菌、乳酸菌

此两种菌在麦汁中也能污染，但生长速度较慢。

发酵阶段

• 变性黄杆菌

此菌主要在酵母接种时污染，种酵母中一般均染有此菌，此菌能使酵母竞争繁殖，在发酵完毕前停止生长。

• 巴氏乳酸菌、醋酸菌

接种酵母中常有此菌，发酵时此两种菌可以生长，开口发酵有利于醋酸菌的生长，密闭发酵有利于乳酸菌的生长。

• 大肠菌群

种酵母中含有此菌。

• 野生酵母

野生酵母主要污染种酵母，尽管接种时污染率很低，但发酵完毕，回收的酵母中，野生酵母的污染率变大。

发酵过程中厌氧条件控制不当时好氧菌的污染情况
过程\种类	霉菌	好氧酵母	发酵酵母	乳酸菌	乙酸军	发酵单胞菌	肠杆菌	厌氧细菌
发酵初期	+	+	-	+	+	-	+	-
发酵中期	-	+	+	+	+	-	+	-
发酵后期	-	+	+	+	+	+	-	+

贮酒阶段

• 醋酸菌

好氧或微好氧醋酸菌在下酒或酒液上部存在空气时繁殖较快，半满的酒桶常会出现醋酸菌污染。

• 乳酸菌、嫌弃发酵单胞菌

此两种菌在厌氧条件下生长，乳酸菌虽然对酒花树脂敏感，但容易形成习惯性耐受。

啤酒生产中有害微生物的检查

病害细菌属的检查

细菌污染的检验方法

• 采用多种选择性培养基

• • 麦汁：主要污染菌有醋酸菌、大肠菌群、多变黄杆菌
    1. 采用Mac Conkey琼脂培养基。大肠菌群可以在1天内检出，多变黄杆菌在3~4天内检出。
    2. 采用葡萄糖-酵母浸膏琼脂，内含10mg/L放线菌酮为基础培养基。在绝氧情况下培养，醋酸菌不生长；培养基中添加10mg/L多黏菌素（Polymyxin），可全部抑制多变黄杆菌的生长；若将基础培养基的ph值调节到4.0，大肠杆菌和多变黄杆菌不能声张。在供氧情况下，醋酸菌以黄色菌落出现。

• • 种酵母：主要污染菌有多变黄杆菌、乳酸菌、醋酸菌
    1. 醋酸菌的检查。啤酒琼脂加酵母浸膏，调节ph值到4.0，添加10mg/L放线菌酮，在倒入培养皿前，添加4%酒精，30℃好氧条件下培养。
    2. 乳酸菌的检查。不加酒花的啤酒琼脂培养基，添加酵母浸膏、麦芽糖、酪蛋白水解物和肝浸膏，调节pH值到6.5，添加10mg/L多黏菌素和10mg/L放线菌酮，以抑制多变黄杆菌和酵母的生长，在25℃，二氧化碳绝氧条件下培养，以抑制醋酸菌。
    3. 多变黄杆菌的检查。深层肝琼脂（deep-liver agar）培养基添加10mg/L放线菌酮，在30℃下供氧培养，多变黄杆菌生长极快，乳酸菌和醋酸菌生长较慢，容易区别。
  • 上述方法培养几天才能得到菌落，乳酸菌则需要7天以上，时间太长。作为常规检查可采用如下快速方法：利用Fuchs-Rosenthal载片（室容量3.2mm³）用作加酒花的啤酒明胶培养基，调节pH值到4.0，添加10mg/L放线菌酮，在30℃下培养24~36h，多变黄杆菌因pH值低受到抑制，不易形成菌落，乳酸菌和醋酸菌形成的小菌落可以镜检，也可从菌落形状加以区别，醋酸菌为球形，乳酸菌为分枝状。

• • 啤酒：主要污染菌有嫌气发酵单胞菌、乳酸菌、四联球菌
    1. 啤酒培养基+葡萄糖（2%）+酵母浸膏（0.05%）+放线菌酮（10mg/L），在绝对厌氧条件下可以检出嫌气发酵单胞菌。
    2. 葡萄糖+酵母浸膏琼脂培养基+10mg/L放线菌酮+0.3%（体积分数）苯乙基醇，在嫌气条件下可以检出乳酸和四联片球菌。

• • 洗涤水：主要污染菌有上述各种菌，分别采用上述选择性培养基进行检验。

• 利用同一选择性培养基

利用李氏多级选择性培养基（Lee's differential agar），简称LMDA。

培养基成分：番茄汁固形物2%（Difco 6035或同类产品），胨化牛奶2%，酵母浸膏1%（Difco 0127或同类产品），葡萄糖1%，泛酸钙0.2%，柠檬酸0.11%，碳酸钙0.5%，磷酸氢二钾0.05%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.001%，硫酸铁0.001%，氧化钠0.001%，吐温80（Tween80）0.05%，溴甲酚红绿0.0022%，放线菌酮0.0007%，琼脂1.5%。121℃蒸汽灭菌10min，温度不宜过高。

可以鉴别出多种污染细菌，培养基中加放线菌酮是为了抑制酵母生长；加碳酸钙是为了鉴别产酸菌；加溴甲酚红绿是为了鉴别着色物质。每个培养基可装15ml培养基，凝固后，于30℃避光保存，避免干燥。培养基应及时使用，或放在5℃下保存。此培养基除对醋酸菌进行有氧培养外，均采用厌氧培养；如果加入苯乙醇0.3%，只能用于分离格兰阳性菌。

培养时，最初两天出现大肠杆菌和多变黄杆菌，4天后，大多数醋酸菌被检出，四联片球菌的检出则需要较长时间。

细菌检查的基本操作

• 取样的容器（如试管、三角瓶）

首先应用棉花塞紧，放在120~150℃干燥箱（或高压蒸汽箱）内，灭菌1h，冷却备用。在使用时，先将瓶外部用75%消毒酒精涂擦杀菌，然后将堵塞瓶口的棉花用火焰杀菌，再用手将棉花塞取下，将欲取的样品放入。此时应尽量保持无菌状态（包括被取样部位的灭菌操作）。

取样后立即塞紧棉塞，随即用防水纸封住瓶口棉塞，用绳子扎紧，以便进行细菌检查。若长时间放置，则样品中的微生物即各自适应其生活环境而进行发育繁殖，以至于与最初状态显著不同，使实验结果发生错误。

• 悬滴检查法

此法虽然不太准确，但可以迅速确定麦汁和啤酒内所含细菌的大致情况。检查方法：用接种针（外径2mm）取样品做点滴镜片，详细计算点滴中的细菌数，并分别以杆菌、球菌、酵母等记录，即可判定欲试溶液中细菌的存在情况。但同样试验应做两次以上。

• 麦汁培养法

此法虽不易正确判定，但最为简单。将试样以无菌操作接入麦汁内，搅动均匀后，放入25~30℃恒温培养箱，每日观察培养基的变化，即检查浑浊、变色、沉淀、生成膜和发酵等情况。至第4天停止培养，并检查其气味等。按下述大致标准判定其微生物。

1. 轻度的浑浊是由乳酸菌或小球菌（Pediococcus）等引起的；红褐色的浑浊是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）的特征；赤色浑浊是由赤色细菌或酵母所引起的。
2. 最初容器底生成浮游物，溶液透明，然后全麦汁铺满菌丝，而溶液仍透明，这是霉菌类孢子发育的现象。
3. 开始生成浑浊，逐渐生成沉淀，第4天则浑浊与沉淀都有，此是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和野生酵母的特征。
4. 最开始生成浑浊并伴有发酵现象，第4天生成沉淀而溶液透明，是培养酵母；发酵后仍浑浊的是野生酵母。
5. 出现浑浊及膜，不生成沉淀，主要是醋酸菌或产膜酵母；出现浑浊皮膜及沉淀的，是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和两三种野生酵母。
6. 实验中的第3天，沉淀与浑浊皆轻微时，是发育不良或繁殖力极弱的特征，例如乳酸菌等。生成大量的沉淀与浑浊的，则是繁殖力强或适合于此麦汁的表现，如Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）和很多种的酵母等。
7. 生成浓厚而坚固的沉淀，是培养酵母；生成泥装沉淀是其他种酵母；飘动的沉淀是细菌。
8. 黄白色的沉淀都是酵母或细菌；暗灰色或灰黄色的沉淀是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属），赤色浑浊及沉淀主要是赤色酵母；沉淀很少是赤色细菌。
9. 试验第1天培养基不伴有其他变化，首先形成皮膜的是需氧型细菌，特别是醋酸菌、枯草杆菌和产膜酵母。
10. 页面成白色随即生成厚的干燥皮膜，然后呈灰白色，有皱纹，并在培养器的边缘上高出且向上的是产膜酵母；柔滑而薄并稍有皱纹，然后干燥成灰色的是醋酸菌；呈有黏着力皮膜的是Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）。
11. 酯香的生成是由产膜酵母等引起；酸味的生成是由产酸菌引起；其他微生物亦可生成特有的气味。

• 平面培养法

主要目的是判定试样中的微生物数目。由于目的不同，培养基分别使用麦汁、中性麦汁、酵母水和肉汁等固体培养基。欲试样品常用液体，如欲试试样为固体时，可将一定量的该试样放入10ml无菌水中充分震荡混合，制成生物分散液。培养时先将试管培养基在水域中溶解，冷却到40~50℃，在无菌箱（或无菌室）中用杀菌锅的吸管吸取样品1ml，注入试管和培养基混合均匀后倒入双重皿中。立刻加盖转动使培养基均匀分布在双重皿内，凝固后倒置在25℃恒温箱内培养2~4天，数其发育的菌落数。以1ml样品中的微生物总数表示其结果，或分别记录其霉菌、酵母、细菌数。

试验空气的平面培养法，将带有固体培养基的双重皿暴露于空气中5min，用于吸收空气中的试验样品，亦按同样方法保温培养，数其菌落数。

• 小滴培养法

这个方法在判定样品中微生物种类（大致区分为霉菌、酵母、细菌三类）相互间量的关系时使用。此法与酵母纯粹培养方法相同。取消毒锅的镊子、接种针、凡士林油、酒精灯、钢笔尖等器械放入无菌箱内；取一片凹穴载玻片，用火焰消毒后，再用钢笔尖沿其凹形上周涂抹凡士林，倒立于无菌箱内壁；再取盖玻片以镊子夹住通过火焰杀菌。用以火焰杀菌过的钢笔尖蘸取样品，点于盖片上，点成3×3或4×4，共9或16个小滴，迅速将盖片上的小滴按入凡士林油的载片的凹形圆环中，两片之间凡士林油不得有空隙。用显微镜检查，记录其中酵母或细菌情况；然后放入恒温箱中，25℃培养3天再检查其中繁殖情况，并分别计算霉菌、酵母和细菌百分率，此试验最少要检查20滴以上。

• 厌氧菌的培养方法

啤酒的污染多为细菌污染，主要是由乳酸杆菌和啤酒片球菌所引起。这些菌均属于兼性厌氧菌，一般要在厌氧条件下才能检出。

利用物理和化学方法，对培养环境进行除氧，创造有利于厌氧微生物生长的条件用以培养检测厌氧菌。

1. 厌氧罐：厌氧罐（gas pak）是一种操作安全、高强度塑料制作的厌氧培养罐，罐体透明，罐内设置有低温催化剂、气体发生袋和快速无氧指示剂。
2. 机械方法除氧：对于专性厌氧微生物的培养，则需要严格的厌氧条件，可采用机械方法除氧，以达到无氧或微氧的培养条件。首先将罐内抽真空，然后使用CO₂或者N₂、H₂与CO₂的混合气体填充罐。

各类污染细菌菌落的检出特征

• 乳酸杆菌属

菌落周围有明显的晕区，晕区大小因菌种而异，培养基颜色由绿变棕黄，菌落圆形，中心深绿色，表面由光滑到粗糙，因品种而异。

• 四联球菌属

菌落教乳酸菌属小，呈黄绿色，极易和乳酸菌属区分，菌落周围亦有清晰晕区，晕区只限于菌落周边，延长培养时间，晕区增大，菌落颜色无改变，菌落为圆形，表面光滑。

• 大肠菌群

埃希菌属菌落圆形，透明，表面极光滑，无晕区；大肠杆菌属的菌落较啤酒其他细菌多得多，光滑，明亮，延伸在培养基表面类似煎蛋状，蓝绿色到黄绿色，因品种而异，无晕区。

• 多变黄杆菌

菌落呈蓝绿色，圆形，边缘及表面粗糙，无晕区，中心颜色略深。

• 醋酸菌

在好氧条件下生长、产酸，菌落周围有晕区，菌落光滑到粗糙，因品种而异，菌落底部呈蓝绿色而乳酸菌菌落底部呈黄色，容易区别（再延长培养时间时，乳酸菌也能在好氧条件下生长）。进一步还可以利用过氧化氢（双氧水H₂O₂）反应区分，醋酸菌对过氧化氢酶呈阳性，而乳酸菌为阴性。

• 发酵单胞菌

菌落圆形，光亮、蓝绿色，较大肠菌群菌落小，不延伸，无晕区，延长培养时间色泽无变化。

病害细菌属的鉴别

病害细菌属鉴别程序

通过上述程序，病害细菌的属明确后，再进一步利用形态和生理特点鉴别菌株。需氧菌和兼性厌氧菌含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢，在活性检查时呈阳性反应。微需氧菌和厌氧菌不含过氧化氢酶，不能分解过氧化氢，在活性检查时，呈阴性反应。

啤酒有害菌的鉴别证明法

啤酒有害菌按其性质大致可分为两种：

• 不论其开始存在的数目有多少，均影响啤酒的质量，例如醋酸菌、乳酸菌、小球菌（Pediococus）和集中野生酵母等。
• 本来没有有害性质，但由于其能繁殖，而对酵母的发育和发酵起到有害作用，例如Thermobacterium（嗜热杆菌亚属）、酪酸菌、野生酵母等。

• 一般试验法

发酵实验有开放发酵试验和密闭发酵实验两种，除特殊要检查厌氧菌外，一般仅用开放发酵实验。

1. 开放发酵实验

已添加酵母的发酵液可直接注入已杀菌的三角瓶中。弱势未加酵母的样品，可取一个已杀菌的小三角瓶于无菌箱中，加入杀菌麦汁，再加入样品，放入25℃恒温箱中培养发酵。同时，另取一个已杀菌的三角瓶加入杀菌麦汁及纯粹培养酵母进行对照试验。观察其3天间的发酵状态，大约3天即可发酵结束。属于上述两种情况中的第一种有害菌，一般是在发酵终了后开始发育并显示其有害作用。因此，需要再于恒温箱内放置3~4天，然后与对照试验相比较。由沉淀、浑浊、皮膜的有无以及臭味等来判定所给予的影响。

1. 密闭发酵实验

最初阶段和开放发酵试验方法相同，即取2只100ml已杀菌的三角瓶，各放入60~70ml已杀菌的麦汁，用已在酒精中浸泡过的胶塞塞紧（注意不得存留空气）。然后用钢丝拴牢，以防试样发酵将瓶塞冲脱。以后的检查方法和开放实验相同。此外，也可以将样品与无菌啤酒一通注满三角瓶加胶塞，直接进行密闭试验。但此法不如前法全面，需氧菌过多时可采用。

• 啤酒培养试验

在杀菌啤酒（或无菌啤酒）中加入样品与发酵实验一样放入25℃恒温箱中，3~4天后进行检查。使用杀菌啤酒与杀菌时所损失的酒精量，应在操作时在无菌箱中事先以酒精补充。所谓无菌啤酒，是杀菌麦汁加纯粹培养酵母，经发酵后制得；这种啤酒除实验室培养的酵母以外，不存在任何菌类。用此方法可以试验已选定的菌对啤酒的影响，如醋酸菌、产膜酵母等。

主要有害细菌的简单鉴定方法

• 四联球菌检出证明法

四联球菌（Pediococcus）在酿造用语上亦称之为伤心菌（Sorcina）或啤酒伤心菌，是啤酒有害菌中最为严重的一种。鉴定方法如下：

取已杀菌的100ml三角瓶，加入样品5ml、酒精2ml和10%碳酸钠3ml，然后加酵母水40ml（酵母水的制备：取压榨酵母100g，放在大烧杯中，注水1L，煮沸30min过滤，过滤后，用1mol/L氢氧化钠中和，如有沉淀或不清，再过滤。放入试管或富氏瓶和平底烧瓶中，以棉花塞紧，用蒸汽杀菌，每日每次30min，连续杀菌3天），加棉塞，置恒温箱中保温3~4天后，用显微镜检查。

• 乳酸菌的检测法

将预先干燥的碳酸钙0.05g与样品一同移入溶解的麦汁固体培养基中。混合均匀后，微浑浊即倒入已杀菌的双重皿中，放在38℃的恒温箱中培养3~4天。如有乳酸菌存在时，所产生的菌落周围是透明的环带。将上面的菌落，再加以碳酸钙平面培养。如再生成此种菌落，即将此菌落移植于500ml麦汁与10~15g碳酸钙的混合液中，在38℃的保温箱中进行培养。培养数日后，至液内已有二氧化碳存在时，过滤。滤液中含有乳酸钙，加浓硫酸，反应后乳酸即游离出来。滤去碳酸钙沉淀后，将滤液蒸发浓缩（以在50~60℃减压蒸发较好），在加硫酸使其呈酸性，用乙醚震荡，则乳酸溶于乙醚中，将乙醚蒸发，取少量残渣，以水溶解，用霍夫曼试剂（Uffelmannrcagent）[1%石炭酸溶液加稀薄氯化高铁（FeCl₃·6H₂O）溶液数滴，溶液即呈青紫色]检查。如有乳酸存在，则紫色渐渐变成黄色，但酪酸等亦同样反应，应进一步检查，另取残渣少量，以水溶解，加入β-萘酚结晶少许，再加浓硫酸加热。加热时如含有乳酸即呈青色。

• 醋酸菌的检测法

醋酸菌在平面培养时，生成的菌落有不规则的边缘，呈青色有光泽，并有醋酸臭味。在啤酒培养基中培养时，最初1~2天内生成稍带青色的有光泽的柔滑皮膜，其后即带有细皱纹，干燥后成灰白色，并散发醋酸气味。以显微镜检查，呈单一或两个联结的杆状，有时呈长的连锁状或老废体；在24h新鲜培养基中，常有运动性。

• 酪酸菌的检测法

酪酸菌为厌氧菌，平面培养基不生菌落，在10°P以下的麦汁中密闭培养可以繁殖，产生酪酸的特臭。酪酸菌都有运动性，且有孢子。利用孢子在高温中短时间内不会死亡的特征，可以检查酪酸菌是否存在。

将被检查的样品移入7%~10%麦汁培养基中，加热煮沸数分钟，使其他菌类死亡，然后加软木塞以隔绝空气，放在30℃恒温箱内培养48h，即产生酪酸的特有臭味（在培养中生成气体，软木塞容易被冲开，应该注意）。以显微镜检查，酪酸菌形状较大，有运动性，有孢子。细胞呈纺锤形，无孢子的细胞呈杆状，以碘液染色染成青紫色。

野生酵母的检查

检查要点

野生酵母可污染冷麦汁、发酵、贮酒各阶段，因此，啤酒厂对野生酵母需要进行经常性的检查。其检查点如下：

1. 野生酵母主要污染种酵母，尽管接种时的污染率很低，但发酵完毕，回收的酵母中，野生酵母的污染率变大。因此，种酵母的检查是重点。
2. 野生酵母在种酵母中所占比率甚小，但啤酒中的野生酵母比率较大，检查两者所含野生酵母的方法不同。
3. 啤酒样品需要做野生酵母检查时，根据其所含细胞数多少确定是否需要做预处理。
4. 在已经过无菌过滤或经巴氏灭菌的啤酒样品中，只含有极少数酵母细胞，需要先经过薄膜过滤，进行浓缩，然后在麦汁琼脂培养基上培养，由此形成的细胞，再进行野生酵母的检验。
5. 若酒样中含有大量酵母细胞（如发酵完毕下酒时的酒样），则先经离心机分离沉淀物，加一点碱液进行镜检，并在如下不同培养基上进行培养。

• 麦汁培养基：所有酵母均可以生长。
• 麦汁+10mg/L放线菌酮：非酵母属的酵母菌株可以生长。
• 啤酒+糖（满瓶，无瓶颈空气存在）：只有微需氧的酵母可以生长，由此培养所得样品，进行麦汁琼脂培养基的平面培养，在以所得菌落进行野生酵母的检查。

野生酵母的检验方法

区别野生酵母和培养酵母的关键在于，区别两者的某些形态和生理上的特点。检验内容主要如下：

1. 外观形态

一般来说，只通过镜检形态，较难区分野生酵母和培养酵母，特别是酵母属的野生酵母。但对有些非酵母属的野生酵母，如毕赤酵母、圆酵母、假丝酵母、酒香酵母等，由于形态差别大，还是比较容易区分的。通过镜检，检验出野生酵母，这种污染往往已经是比较严重了，在生产中常会出现异常现象，如风味变异、酒液不澄清等。

1. 抗热性能

啤酒酿造中遇到的一些野生酵母，其灭死温度均较培养酵母高。将含有一定细胞数待检样品的悬浮液，先进性50℃、20min的加热处理，排除培养酵母。冷却后，摇动均匀，取1ml悬浮液进行固体平面培养，生存的细胞都是野生酵母，主要有圆酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母和一些易形成浑浊的酵母属野生酵母。

1. 孢子形成试验

野生酵母较培养酵母容易生成孢子，先按上述抗热性能试验，将待检样品进行处理，排除培养酵母。冷却后，取2ml待检悬浮液，移植至10ml麦汁中，在25℃、48h，然后取沉淀的酵母移植到醋酸钠琼脂培养基（醋酸钠培养基的组成：葡萄糖0.06%，蛋白胨0.25%，醋酸钠0.5%，琼脂2%，调节pH值到7.0）上，进行孢子形成试验，在25℃、48h内形成孢子者为野生酵母。利用此法，野生酵母可以在1/500000的低浓度下被检出。此方法有局限性，因为很多野生酵母如假丝酵母、圆酵母等并不形成孢子，但这些酵母在形态上还是比较容易区分的。

1. 糖类发酵

上面发酵啤酒酵母能发酵葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、1/3棉籽糖，但是不能发酵蜜二糖；下面发酵啤酒酵母则能全部发酵上述糖类；野生酵母大都不能全部发酵上述糖类。如果再采用一些培养酵母不能利用而野生酵母可以利用的糖类，如阿戊糖、甘露醇糖、鼠李糖、山梨糖等作为选择性培养基，一些酵母属的野生酵母和假丝酵母、圆酵母都可以检出。

1. 选择性培养基鉴别法

利用不同酵母在不同培养基上的生长情况进行鉴别，这是目前最常用且有效的方法。啤酒厂常用于检验野生酵母的选择性培养基有以下几种

培养基名称	活性成分	作用
赖氨酸培养基（以赖氨酸为唯一氨源）	盐酸赖氨酸	检出非酵母属的野生酵母
放线菌酮培养基	2~4mg/L放线菌酮	作用同赖氨酸培养基，但放线菌酮浓度在0.2mg/L以下时培养酵母也能生长
结晶紫培养基	20mg/L结晶紫	能检出赖氨酸培养基不能检出的大多数野生酵母
史瓦兹培养基（Schwarz differential medium，简称S.D.M）	品红亚硫酸盐混合物（0.3%~0.5%）	应用于所有野生酵母
林氏培养基（Lin's medium）	品红亚硫酸盐+结晶紫	与赖氨酸培养基协同作用，检出非酵母属的野生酵母

• 赖氨酸培养基

此法简单易行，很多野生酵母可以检出，但酵母属的野生酵母不能检出是其缺点。此类酵母是啤酒厂常遇到的野生酵母，容易形成浑浊。赖氨酸培养基的配方和制备方法如下：

• 溶液A：硼酸0.1g，硫酸锌0.4g，钼酸铵0.02g，硫酸锰0.04g，硫酸亚铁0.25g，加水至1000ml。
• 基础培养基B：葡萄糖50g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，氯化钙（熔融）0.2g，氯化钠0.1g，腺嘌呤0.002g，DL-蛋氨酸0.001g，L-组氨酸0.001g，DL-色氨酸0.001g，溶液A1ml，乳酸钾（50%）12g，琼脂20g，加水至1000ml，以乳酸菌调节pH值到5.0~5.2.
• 赖氨酸溶液C：L-赖氨酸10g加水至1000ml。
• 溶液D：肌醇2g，乳酸钙0.2g，盐酸硫胺素0.04g，吡哆醇0.04g，对氨基苯甲酸0.02g，核黄素0.02g，生物素0.0002g，叶酸0.0001g，加水至1000ml。
• 上述溶液B、C、D，分别简写蒸汽灭菌30min，连续3天，取溶液B 89份、溶液C 10份在45℃~50℃下混合均匀。每100ml混合液可制备8套培养皿，在37℃下保温过夜备用。
• 检查方法：将待检酵母试样，用无菌水离心洗涤3次，取0.2ml悬浮液，以上述培养基做划线平面培养，25℃保温，每天观察其生长情况，计算菌落生长数，即为野生酵母，并按原接种量换算每百万细胞内的野生酵母数。

• 放线菌酮培养基

培养基中添加2~4mg/L放线菌酮，就可抑制培养酵母，很多野生酵母，如毕赤酵母、圆酵母、酒香酵母等，可以检出。酵母属的野生酵母不能被检出。

• 结晶紫培养基

结晶紫培养基中含有20mg/L结晶紫，能抑制啤酒酵母生长，如巴西酵母、啤酒酵母椭圆变种和糖化酵母等均可以检出。

大多数赖氨酸培养基不能检出的酵母属野生酵母，用结晶紫培养基可以检出，而赖氨酸培养基可以检出的多数野生酵母用结晶紫培养基不能检出。此两种培养基结合运用，可以达到很好的互补检出效果。

• 史瓦兹培养基

啤酒酵母在此培养基内受到抑制，不生长或生长很慢，只形成不明显的菌落，而野生酵母的生长不受抑制，可以形成巨大菌落。从菌落的形态、大小和色泽可以检出某些野生酵母，如假丝酵母、汉逊酵母、糊精酵母和啤酒酵母椭圆变种等。

培养基的配方如下：

• 基础培养基：麦汁浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，酵母浸膏0.3%，琼脂2.0%。
• 品红亚硫酸混合物（0.3%~0.35%）：碱性品红4g，无水亚硫酸钠25g，糊精1g，在乳钵中混合研磨后，在干燥器中存放3天，然后置于密封的黑棕色瓶中备用。
• 培养基的制备：将以上成分混合，加入需要量的蒸馏水，煮沸15min，冷却至45℃，将培养基倒入已灭菌的平面皿中，在室温下固化，然后在30℃保温贮存，过夜备用。

此培养基的效果随贮存时间延长而降低，在检查时，必须采用新制备的的培养基。

• 林氏培养基

啤酒酵母在此培养基内受到抑制，不易生长，而野生酵母则能形成明显的巨大菌落。有少数野生酵母在林氏培养基中不能检出，在赖氨酸培养基中可以检出。此两种培养基协同运用，可以达到良好的检出效果。

培养基的配方如下：

• 基础培养基：麦芽浸膏0.2g，酵母浸膏0.4g，琼脂2.0g，蛋白胨0.2g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钾0.1g，氯化铵0.05g，蒸馏水100ml。
• 品红亚硫酸盐混合物0.1g（处理方法同史瓦兹培养基）。
• 结晶紫0.4~3.5mg/L。结晶紫原液的制备方法如下：含88%的结晶紫0.1136g，溶于0.5ml95%酒精内，用蒸馏水稀释成100ml，置2℃保存。使用时，将原液稀释成需要的浓度。
• 培养基的制备：将上述成分悬浮在所需量的水中，加热煮沸；在0.1MPa压力下，加热15min，冷却，倒入培养皿中，此培养皿置5℃左右温度下静置24~48h备用。

应用：每一个培养皿中加入0.2~0.3ml含1×10⁶以下细胞数的接种体，使其均匀分布于培养基表面上，置25℃保温，观察4~6天后，培养基上形成的明显菌落为野生酵母。

1. 免疫荧光法

这是当前检出野生酵母灵敏度最高的方法，它不但可以检查出用其他方法不易检出的酵母属野生酵母，而且其检出灵敏度非常高，可以在百万个以上的培养酵母中检出个别的野生酵母。但此法需制备必需的抗血清，一般不作为常规方法使用。

野生酵母的鉴定

• 酒石酸法

利用2%浓度酒石酸的无菌麦汁，培养待检查的酵母种，由于高浓度的酸抑制了啤酒酵母和某些细菌的生长，在25℃~30℃恒温箱中培养48h，如果有微生物生长，可以初步认为有野生酵母污染。但如果污染了不耐酸野生酵母，则不能生长而无法判别。

• 芽蔟的检查

将现场使用的酵母稀释，并制成悬滴镜片，在显微镜下观察酵母的结构，因为凝集力是由于芽蔟形成而致，如果识别有困难可以在酵母种加低浓度的氢氧化钾溶液或者稀醋酸溶液，再进行镜检，此时，凝集酵母即个个分离，而芽蔟细胞仍存在。下面发酵现场使用的酵母如有芽蔟存在可认为是由于异种酵母的混入。

• 酒石酸蔗糖法

取适量被检酵母菌试样，加入无菌酒石酸蔗糖溶液（配置方法：酒石酸40g，蔗糖100g，蒸馏水1000ml，常压间歇灭菌）内于25℃培养48h，以控制细菌及培养酵母繁殖。将酸性上清液倾去，加入新鲜麦汁发酵。如此，反复经过2~3次一直，最后发酵终了，将沉淀酵母移植于 石膏块上，或者在胡萝卜片上进行孢子培养。石膏块（8份熟石膏+3份水）应先用刀刮平，中间做一个凹穴放在双重皿中杀菌。将已繁殖的酵母滴入石膏穴中，然后加入无菌水或无菌麦汁至浸渍石膏块的2/3为度。将已灭菌的小滤纸片放在双重皿底面的口上，盖好双重皿，于25℃培养72h，用显微镜检查孢子形成情况。此时野生酵母已经形成孢子，再做染色检查，认真判断。此试验由于酸的控制，仅野生酵母可以发育，因此，对不形成孢子的野生酵母，亦能检出。但此法中丛梗孢属、白粉菌、暗色孢霉等亦能生长，故需要注意。

• 加热法

将被检酵母菌试样加热至50℃ 20min，杀灭大部分培养酵母，立即用水冷却，然后移植于麦汁观察野生酵母的生长或在醋酸钠琼脂培养基（配置方法：葡萄糖0.6g，蛋白胨2.5g，醋酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。调节pH值到7.0，常压间歇灭菌）上观察产生孢子情况，异常使用的酵母如有芽蔟存在可认为是由于异种酵母的混入。一般25℃ 72h野生酵母可形成孢子，而培养酵母则需要72h后方能形成孢子。

• 滤纸法

取一个培养皿（高5cm、直径7cm），将一滤纸放在金属钢架上纳入培养皿中，使其在皿中做倾斜状，一面翘起，一面触及皿底。然后注入0.5%醋酸钠溶液，使滤纸部分浸入该溶液内。用无菌吸管吸取被检酵母菌试样加在滤纸上，经培养40h后，取样观察是否有孢子产生，如已形成孢子，可再做孢子染色检验。

• 高氏（Golloway）法

所用培养基为沉淀磷酸钙0.5g，琼脂1.5g，水1000ml。将上述培养基在121℃灭菌20min，使用时倒成平板并尽可能保持碳酸钙成悬浮状态而凝固。该培养基无营养，故酵母难以增殖，接种量要大，也可做划线。于25℃保温培养，大部分孢子的酵母即出现子囊孢子。

霉菌的检查与鉴定

一般房屋空气中都有相当数量的霉菌孢子存在，较为常见的是根霉、毛霉、青霉和曲霉等。如用杀过菌的察氏培养基平板，开盖暴露于空气中，几分钟后即加盖进行培养（25℃~30℃）将会有霉菌生长。

霉菌大部分在常温下生长，适宜温度为25~30℃，也有能耐35℃以上高温的。而有的则喜欢较低的温度。湿度是霉菌发芽的必需条件，限制湿度可以阻止霉菌生长，霉菌能在较广的ph范围生长，不过大部分喜欢酸性。霉菌是好氧性微生物，故啤酒厂一般不把霉菌看成病害微生物。因为缺氧，它们不宜在啤酒内生长，然而许多霉菌能生长在啤酒表面。霉菌污染虽然没有野生酵母、细菌污染那样严重，但是也应该引起注意。

啤酒厂中超市的枪毙、地板、天花板、脏桶、空桶以及暴露在空气里的酵母泥上面，还有一切沾有啤酒残渍污染的地方，均能滋生霉菌。日常，要注意整个啤酒厂的清洁卫生工作，检查一切不干净的地面、死角，随时修理漏酒管道和阀门，被啤酒玷污过的地板和墙壁、木制工具和木质发酵容器要经常洗刷，工具用后浸入灭菌水中，必要时对经常染菌的天花板、墙壁等可用防霉涂料，以上措施对防治霉菌和细菌污染是极为有效的。

生产过程中微生物的检查与控制

要防止杂菌的污染，平时需要进行经常性的微生物检查和严格的清洁灭菌管理。防止病害微生物的污染，主要是对微生物的控制，在实际生活中，每天均进行详尽的检验是不可能的，可定期在重点部位取样检查，有些项目可作为常规控制，经常检查分析，并对啤酒厂经常检出的杂菌有所了解，发现污染，即进行详尽检查，找出污染源，并设法处理。检验不出有污染，说明工厂的清洁卫生工作和酵母条件较令人满意。

空气的细菌检查

前已述及，在啤酒生产过程中，无论是传统生产工艺还是现代化发酵啤酒生产工艺，冷却麦汁中发酵初始一般要求含氧量在6~10mg/L。因此，在冷却麦汁过程中需要通入“无菌空气”，特别是传统发酵生产，开口发酵需要保持室内空气无菌条件。啤酒厂的污染，空气是主要来源之一，因此，了解空气中的细菌数是有意义的，应对无菌室、压缩空气、发酵室等经常进行检查。

空气中的细菌数检查，最简单的方法是利用平面捕捉法，以求其在一定时间内落于培养基表面的细菌数。方法为：先将约10ml的麦汁固体培养基熔化，以无菌操作倒入双重皿内，摇动使其均匀凝固后，放在要检查的场所中央。将门关闭，停止空气流动，将双重皿的盖打开，放置5min，而后将盖子盖好，并用纸包裹，置于25℃恒温箱中3~4天。取出，检查酵母、霉菌、细菌等繁殖的菌落，分别予以记录。

检查压缩空气污染很重要，但目前尚无好的方法。现有的方法较复杂，首先要对空气定量，要配有流量计，然后用生理盐水或0.5%蛋白胨溶液吸附，再用平板法计数。此法工厂不乐于使用，简单测定可直接用培养皿检查：

先以酒精将压缩空气排气口杀菌，再以火焰充分杀菌。将排出的压缩空气排放半分钟，用盛有固体培养基的双重皿捕捉1min，加盖，并用纸包裹，置于25℃恒温箱中培养3~4h。取出，检查菌数、细菌和野生酵母的菌落，并分别予以记录。

啤酒生产中重点部位的取样和检验

发酵工段

在发酵工段中，麦汁、种酵母受杂菌感染的机会较多，若洗涤发酵容器和管路不彻底，其最后的洗涤水中也会存在杂菌。均需要经常进行病害微生物的检验。

1. 麦汁

• 取样：冷麦汁出口处，在麦汁开始流出时和流出30min后取样。检查内容如下：

1. 稳定性的测定

在无菌条件下，迅速取麦汁样品，装入无菌试管中，并立即用棉花塞将试管口塞好。将试管放置于室温下，记下麦汁开始发生变化的时间，麦汁的生物稳定性指标规定如下：

麦汁开始发生变化时间＜24h，不好；

麦汁开始发生变化时间＜36h，可以；

麦汁开始发生变化时间＜60h，良好；

麦汁开始发生变化时间≥90h，优良；

当麦汁发生变化以后必须对生产的菌膜或浑浊沉淀物进行镜检以确定引起这些变化的微生物的基本种类。

1. 总污染度

测出1ml麦汁中微生物的总数，就可以判断麦汁的污染度。此种分析每周进行一次同时单独地计算细菌、霉菌和野生酵母的数量，最好从两次不同的稀释中取其均值。结果表示方法为：

总污染度＜10个/ml，麦汁为良好；

总污染度＞1000个/ml，麦汁为不好；

若30min后取样的总污染度仍然很高，说明设备和管路的灭菌工作有问题，应该进行彻底清洁灭菌。

1. 大肠菌群的检查

麦汁中最易感染大肠菌群，可用Meconkey培养基进行检查。

1. 种酵母

• 取样：用无菌吸管插入酵母槽底部取样，注入无菌粗试管中备用。检验内容如下：

1. 酵母的镜检

镜检出不合要求酵母，此种酵母将会影响啤酒发酵，不得应用于生产。

1. 形态。正常的底面啤酒酵母细胞应为卵圆形，其大小为6~10μm，细胞质较稠密且均匀。若出现较大液泡和具有颗粒状细胞质的细胞以及不发生芽殖的细胞，说明酵母变老，在这种情况下，酵母在使用之前必须复壮。
2. 酵母细胞中肝糖的含量。根据酵母细胞中肝糖的含量就可以了解酵母的发酵能力。测定肝糖的含量，可用Lugol碘液染色，经过5~6min后，放在显微镜下观察。它与碘化合时呈棕褐色。当不存在肝糖时，细胞染成黄色。计算10个视野内肝糖细胞的百分数。在正常酵母中，70%~75%的细胞都含有肝糖。含肝糖的细胞数量少，则说明酵母细胞衰老或营养缺乏。

采用含肝糖少的酵母发酵，可延长主发酵的周期。酵母细胞中肝糖的含量因酵母的贮养条件不同而迅速变化。酵母在水中长期贮养，以及高温度都能促使其中肝糖的含量大大减少。肝糖含量低的种酵母在使用之前亦应复壮。

1. 丝酵母细胞的测定。死细胞含量是种酵母的重要质量指标。测定死细胞数的方法可用次甲基兰稀溶液进行染色后镜检。新培养酵母染色细胞极少，一般要求在1%以下。如果死细胞超过10%则会造成一系列不正常现象：主发酵缓慢、萎靡，刺激了球菌的繁殖，啤酒中产生酵母自溶味。
2. 杂菌的含量。为了使蛋白质溶解，可加入一滴10%的碱液，取样在显微镜下镜检，每次镜检不少于25个视野，每个视野内应该有大约40个酵母细胞。这样，就可以观察1000个酵母细胞，并计算出其中野生酵母和细菌（通常为乳酸菌）的含量。细菌含量不超过1%，野生酵母不超过0.5%的种酵母可以认为是合格的。根据在25个视野内杂菌的含量，检定酵母质量的大致标准如下：

杂菌数量0~2个，种酵母评价为优良；

杂菌数量2~4个，种酵母评价为良好；

杂菌数量4~10个，种酵母评价为可以；

杂菌数量10~50个，种酵母评价为不好；

1. 总污染度

按上述选择性培养基（放线菌酮培养基）的方法，进行野生酵母和细菌的检查，如总污染度超过0.1%，则需要更换酵母并进行彻底灭菌。

1. 嫩啤酒

发酵完毕下酒时，从发酵罐中取出试样，进行离心分离，将液体倒掉，其沉淀物加一滴碱液进行镜检，当发现有杂菌存在时，进行麦汁（加酒花及10μg/g放线菌酮）琼脂的平面培养，求其杂菌总数。如果已经掌握污染是属于哪一种杂菌时，检验范围可以缩小到只针对这一种杂菌的检验，其效果较测总污染度更好一些。

1. 洗涤水

检查洗涤水的目的是为了检查设备洗涤的质量。设备洗涤后，从最后一次洗涤水中取样，检查其菌体繁殖能力及细胞数。一般重点检查冷却器、酵母槽、发酵罐、橡皮管、麦汁管路和啤酒管路的洗涤用水。

1. 镜检：

取最后一次洗涤水5~10ml，以1500~2000r/min离心分离10min。将上层液体倾去，去沉淀进行镜检，在不少于10个视野内观察，当洗涤质量良好时，其中不应有5个以上的微生物细胞，如果每个视野中都有微生物，则证明设备洗的不干净，必须重新进行清洗。

1. 总菌体繁殖力的测定：

从最后一次洗涤水的试样中取0.1~1ml，进行平板稀释培养，当洗涤质量良好时，洗涤用水中微生物的总数不应该与洗涤用水中的微生物有很大差别。

贮酒工段

啤酒在贮酒罐中受感染的机会较少，但是每天进行微生物检查仍然是必要的。倘若贮酒罐洗涤不干净、橡皮管和啤酒管道的卫生欠佳、贮酒罐酒装的不满或助滤剂处理不当，都会使啤酒在最后的生产阶段受到污染。

1. 贮藏啤酒及过滤啤酒的检验

取样地点：滤酒前及滤酒后的酒样。

检验内容：滤酒前酒样的检验同嫩啤酒；滤酒后酒样需先经薄膜过滤浓缩样品，然后进行平面培养。

1. 洗涤用水的检验

同发酵工段用水的检验。

1. 滤饼的检验

由于成品啤酒的生物稳定性与滤饼的洗涤质量关系很大，因此必须系统地检查滤饼的洁净程度，并且每周不得少于一次，测定其在麦汁中的生物稳定性及其总污染度。

（略）

1. 灌装工段

装酒容器的洁净程度，对于啤酒的生物稳定性有重大意义，应该经常进行微生物检验。

1. 酒瓶

取5个洗过的酒瓶，把瓶中残存的水倒入一个无菌瓶中，将此水进行稀释，进行固体平面培养，经过48h培养后鉴定洗瓶的质量，如果1ml洗涤水中的微生物与1ml用于洗涤用水中的微生物数量没有多大区别，则说明瓶子已经洗干净。

另一种方法是测定洗过的酒瓶中的微生物总数。即向5~10个西帝国的酒瓶中，依次倒入20ml无菌水，并用力震荡5min，将此水接到麦汁琼脂培养皿中，在25~28℃下培养48h，最后折算成一平中所含的微生物总数。

1. 瓶盖与瓶垫

为了测定瓶垫的清洁度，从浸泡瓶垫的水中取样300~500ml倒入无菌玻璃瓶中，并培养检查细菌总数和是否存在大肠菌群。

瓶盖直接用无菌镊子从工作地点取10个，放入无菌的广口瓶中，注入10ml无菌水，摇动5min，取此水进行平面培养，并折算每个瓶盖上的微生物总数。每个瓶塞上的微生物数量不超过100个。

1. 啤酒

取样地点：进入装酒机前后的酒样。

检验内容：同过滤啤酒。

1. 洗涤用水的检验。同发酵工段用水的检验。

啤酒厂主要生产工序微生物控制指标

选择性培养基的应用

培养基可以分为选择性培养基和非选择性培养基。选择性培养基只检测对产品有害的微生物，而非选择性培养基则可将所有存在的微生物都培养出来。

NBB是德国慕尼黑工业大学研制的一种啤酒有害菌专用培养基。该培养基由于加入了放线菌酮以及多种营养物质（如酵母浸膏、牛肉浸膏、葡萄糖、麦芽糖、L-苹果酸等），可以抑制酵母菌和啤酒无害菌的生长，为啤酒有害菌创造最适宜的生长条件。

另外，在NBB-A和NBB-B种，加入了酸碱试剂，以指示酸碱变化，遇酸变黄，遇碱变红。

培养基NBB几乎可以检测啤酒厂中的全部样品，如各类澄清样品、浑浊样品以及各种气体样品等，而且操作简单、鉴定迅速。当污染较严重时，样品只需培养1天即可；当仅有痕量污染时，微生物生长特别缓慢，培养时间也只需数天（在25~28℃条件下，NBB-A和NBB-B只需培养5天，而NBB-C只需要培养5~10天），与其他检测方法相比缩短了培养时间。另外，极其重要的一点是NBB培养基的检出选择性非常高，在所有的NBB产品中，只要保证严格的厌氧环境，则在其上生长的均为啤酒有害菌。此外，在好氧条件下，NBB的检测范围也较宽，即在所有的NBB产品中能够生长的都是啤酒有害菌和指示性微生物，尤其是NBB-B，检测指示性微生物的可靠性最高。

固体培养基NBB-A

NBB-A主要用于检测啤酒和酵母中存在的啤酒有害菌，它适用于培养已发现的所有啤酒有害菌，特别是乳酸杆菌、四联球菌以及果胶杆菌和巨型球菌等。常用的检测设备有：不锈钢漏斗式过滤器（有单联、三联和六联式三种规格）、喷灯（进行火焰灭菌）、低噪声真空泵、真空管、真空保护器、细菌计数器以及镊子等。

使用方法

使用时，先用沸水或高压蒸汽将瓶装NBB-A进行液化处理，在液化时避免长时间过度加热，然后将液化好的培养基约15ml立即倒入无菌平板中，置于冰箱中备用。但其贮存时间不应超过4天，否则培养基平板汇脱水干燥，而作为啤酒有害菌的乳酸杆菌对干燥非常敏感，在长时间贮存的NBB-A平板上不能生长。

培养条件

1. 培养温度

一般控制在25~28℃培养，不能超过28℃。因为在较高温度下部分啤酒有害菌无法生长。

1. 培养环境

由于所有的啤酒有害菌都是微需氧或严格厌氧的，所以，应在厌氧环境下进行培养。现在进行厌氧培养时，一般都采用厌氧培养罐。在米碧德厌氧罐里，通过化学反应，氧气被消耗掉，同时产生二氧化碳或氢气。当然也可以用CO₂洗涤技术，先抽真空再充CO₂，以达到厌氧环境。对常见的啤酒有害菌乳酸杆菌和四联球菌来说，这样的环境已经足够了，因为它们是微需氧菌，能够生活在二氧化碳与少量氧气的混合状态下。而对于较罕见的啤酒有害菌果胶杆菌和巨型球菌来说，由于它们是专性厌氧菌，只有在氧含量小于0.2mg/L时才能生长，因此，培养时，培养皿上最好有透气的凸点来完成内外的气体交换，以保证培养皿内有充足的二氧化碳。

1. 恒温培养时间

一般为2~5天。培养时间取决于微生物的生长速率（取决于种、属）、菌龄、生理条件、培养的环境以及微生物的起始细胞数等。如果样品中有大量的啤酒有害菌，那么在2~5天内培养基中的酸碱指示剂将因有害菌产酸而变黄；如果样品中只有很少的啤酒有害菌存在，那么培养基只有菌落的边缘区域会变黄，而且颜色的改变通常需要4~6天。

应用范围

• 检测酵母

取0.1~1.0ml酵母涂布，接种在NBB-A平板上，要求图层薄而均匀。被涂上的酵母在NBB-A上几乎不生长，而酵母中的啤酒有害菌却能良好生长，因此，在显微镜下很容易检查出来。在大多数情况下，特别是在较严重污染啤酒有害菌的情况下，NBB-A将会变黄。

• 检测啤酒、水等澄清透明的液体

将被检测样品进行膜过滤，过滤量为50~100ml。最好使用普通孔径0.45μm的白色过滤膜，做完膜过滤后，将过滤膜置于NBB-A上。具体步骤如下：

1. 启封成品培养皿包装，编号。
2. 用定量注射器将3.5ml无菌水均匀湿润培养基，无菌操作。
3. 打开真空阀，用喷灯对过滤器仔细灭菌10s。
4. 用喷灯对过滤漏斗内部彻底灭菌。
5. 将过滤膜片小心取出放到过滤器上部。
6. 将漏斗与过滤器连接好后再灭菌处理。
7. 将待过滤样品倾入漏斗中，压好上顶盖。
8. 启动真空泵抽滤，结束后取下过滤膜片。
9. 将富集被截留物质的膜片放入培养基中。
10. 放入培养箱（厌氧）中进行恒温培养。

需要注意的是，有些菌种如林德氏乳酸杆菌在NBB-A上培养时，特别是在放置时间较长的NBB-A上，由于缺乏水分以及营养物质不能流动而造成多肽类营养物质（如P-因子）匮乏，使得这些菌种在过滤膜上不能生长或生长缓慢。因此，检测重要样品时，在将过滤膜置于NBB-A上的同时，也应将此同一样品的过滤膜置于NBB-B中培养。

• 检测需要划线培养的样品

需要划线的样品通常是经过NBB-B和NBB-C处理过的样品。因为NBB-B和NBB-C都是液体培养基，所以不能做菌种特性鉴定。在不清楚NBB-B和NBB-C种生长的啤酒有害菌属于哪一类型的情况下，可以用接种环从富集培养的样品中取1~3环，在NBB-A上做平板划线分离或平板划线增殖，待长出菌落后，即可进行鉴定。

检测结果鉴定

• 酵母

由于NBB-A中有放线菌酮，因此，培养酵母不能生长，而野生酵母却能生长，但颜色不会变化。

• 非啤酒有害菌

非啤酒有害菌包括小球菌、醋酸菌等，它们是典型的需氧菌，在NBB-A上一般不能生长。当膜过滤器中、膜片下残留有氧，或厌氧环境失败而达不到厌氧条件时，这些非啤酒有害菌可能会生长。但是这些非啤酒有害菌的生长是非常微弱且缓慢的，通常NBB-A不会变黄（醋酸菌可引起菌落周边区域变黄）。另外，非啤酒有害菌的乳酸菌，大部分在NBB-A上生长非常微弱、缓慢，而且在啤酒和酿造酵母中出现的概率非常小。

经膜过滤后，大量样品的死细胞和非啤酒有害菌会再次滞留在滤膜上。因此，不能以直接镜检膜片的结果作为判断依据。在NBB-A上判断有微生物生长的依据是有菌落形成，并且通常伴随有NBB-A颜色的改变。

• 啤酒有害菌

如果有啤酒有害菌，则NBB-A会显著变黄，并在NBB-A上生长出无色、白色至黄色的直径为0.5~3.0mm的菌落。反之，通过NBB-A变黄，可以判断所检验样品中可能存在啤酒有害菌。在不能确定是否有啤酒有害菌的前提下，特别是在NBB-A上仅有零星的、不规则斑点的菌落生长时，可将此村中菌落接种到低酒花啤酒中，来确定它们是否会对啤酒产生危害。若此菌落在低酒花啤酒中能生长，则是潜在啤酒有害菌；若此菌落在低酒花啤酒中不能生长，则为啤酒无害菌。

当然，啤酒厂的最佳状况是NBB-A上的样品结果为阴性，即在NBB-A上无菌落生长出来。

液体培养基NBB-B

NBB-B液体培养基检测范围较广，能检测酵母、麦汁、浑浊啤酒、二氧化碳气体、压缩空气、成品啤酒以及啤酒生产过程中的二次污染等。其使用方法是，在无菌状态下将瓶装NBB-B分装到无菌试管中（每支试管10~20ml），或再次短时灭菌。短时灭菌应该避免过热，否则容易使已经形成的轻微蛋白质沉淀加强，指示剂颜色加深，同时其它营养物质和酒花苦味物质也会受到不良的影响。同NBB-A一样，NBB-B也是在25~28℃恒温厌氧培养，试管口要用一个透气的塞子（如棉塞）来保证气体的交换。培养时间为2~5天。

检测酵母

酵母样品的检测应该最严格，所以不仅要检出专性啤酒有害菌，而且应该检出所有的潜在啤酒有害菌及间接啤酒有害菌，在有氧条件下还需检出可能存在的指示性微生物，如醋酸菌、肠杆菌、多变黄杆菌等。NBB-B检测指示性微生物的可靠性最高。

• 检测方法

用NBB-B检测酵母的方法主要有两种：

1. 用无菌吸管取0.5~1ml酵母置于10~20ml NBB-B中，按此比例可检测更多的酵母。或在酵母容器不同的位置，直接采用无菌棉签取酵母或沉积物样约0.5ml于无菌试管内，然后注入约70%的NBB-B培养基（约15ml）。由于酵母的加入，一开始会有发酵现象，产生二氧化碳，因此，培养时是自然的厌氧（二氧化碳）环境，无需再做厌氧处理。然后，在NBB-B中抑制剂（如放线菌酮）的作用下，纯种酵母很快停止生长，可能存在的啤酒有害菌会充分地利用剩余的营养及生长物质。当然，对于NBB-B样品也可进一步做厌氧处理，以更好地检出乳酸杆菌、四联球菌等啤酒有害菌。

1. 对于较大量的酵母1~4ml，可采用50ml卡箍式取样瓶，其中装入20~30ml NBB-B。当酵母量再增大时（10ml），则可以采用NBB-C来检测。

对于上述两种方法，如果酵母量大或酵母沉淀结实，就有可能出现其中的单个微生物接触不到NBB-B培养基的情况，此时必须借助摇床等方式，使培养液能够缓慢摇荡，摇床转速一般为125r/min。由于震荡作用，酵母不能沉降，可能存在痕量污染的啤酒有害菌就能够得到较好的营养，因而检出灵敏度将提高。

• 检测结果鉴定

在达到一定污染程度或有典型啤酒有害细菌存在时，NBB-B中的酸碱指示剂会由红变黄。但是，在痕量污染（极轻微的污染）时，NBB-B将不变黄；巨型球菌、潜在啤酒有害菌多变黄杆菌以及发酵单胞菌不能使pH值降到5.0以下，因而不会让NBB-B变色；若酵母自溶产碱，会使pH值上升，也导致NBB-B不变黄等，因此，对于用NBB-B培养后的酵母，一定要做直接镜检。

在NBB-B中，啤酒有害细菌会迅速、大量生长，因而在显微镜下很容易识别出来，一般在一个视野中会出现多个可疑细胞。如果细胞为单个形式，当放大倍数为600倍时，10个视野中只存在1~3个细胞，则表明此微生物为死细胞或无害微生物，在用NBB-B培养之前它们已经存在于样品中了。如果无法确定这个NBB-B培养后的结果，可以将这个经NBB-B培养后的样品再次接入NBB-B中，经过这样的二级培养后，如果样品中存在啤酒有害菌，那么在两天内就会迅速生长出来，导致NBB-B变色。

检测麦汁

用NBB-B检测麦汁常有两种方法。

• 180ml卡箍式取样瓶中加入40ml麦汁，再加巴氏灭菌后啤酒100ml，再加入NBB-B 10ml，在25~28℃条件下，恒温培养5天。如果存在啤酒有害菌，则液体变浑浊。这里不是看颜色变化，而是看是否产生浑浊。若麦汁直接进行保存培养，是不会生长啤酒有害菌的，所以，需要加啤酒来创造选择性的培养环境，以检出啤酒有害菌。

• 膜过滤40~50ml麦汁，过滤膜置于NBB-B中，在25~28℃条件下，恒温培养5天，观察颜色变化。如果存在啤酒有害菌，则NBB-B将变黄。

检测浑浊啤酒

浑浊啤酒主要指前酵液、后酵液等含有酵母的酒液，可用一个较大的瓶子（如500ml卡箍式取样瓶）取样后置于冰箱中，使酵母沉淀。若有啤酒有害细菌存在，则会随浑浊物一起沉降至底部，上清液可以倾倒掉，用无菌吸管或无菌棉签取底部沉淀大约0.5ml，然后用与上述“检测酵母”相同的方法处理样品。这样检测未过滤的浑浊啤酒，所检出微生物会受到一定的限制，但样品培养时间较短。实际上，最好用NBB-C来检测浑浊啤酒。

检测压缩气体、二氧化碳

取20~30ml NBB-B于50ml卡箍式取样瓶中，让气流低速充入其中，约1min。注意气体流速不能太大，一面将压缩气体或二氧化碳中的啤酒有害菌直接带出取样瓶，而不被检测到。

检测清酒、成品啤酒

主要有以下三种检测方法：

• 膜过滤法

过滤100ml啤酒，然后将过滤膜卷起置于NBB-B中，在25~28℃条件下，恒温厌氧培养5天。如果存在啤酒有害菌，则NBB-B将变黄。

• 直接加入法

将成品罐装啤酒开盖，加入10~15ml NBB-B（只需将瓶颈灌满即可），然后封上瓶盖，在样品保存培养箱中培养。由于NBB-B可提供营养，能促进啤酒有害菌生长，所以培养时间只需10天，而不是6周。如果样品中存在啤酒有害菌，培养时会形成浑浊、沉淀，但是没有颜色变化。这里也是看浑浊、沉淀，而不是看颜色变化。

• 过滤膜和啤酒混合法

这是检测专性啤酒有害菌的最佳方法。具体方法是，未超过保质期的清亮无菌啤酒倒入50ml无菌卡箍式取样瓶中，装至瓶颈出，然后放入过滤100ml啤酒之后的过滤膜，并用NBB-B注满取样瓶。若样品量较大，可取40ml样品放入50ml卡箍式取样瓶中，剩余样品全部做膜过滤，然后将过滤膜放入取样瓶中，用NBB-B灌满取样瓶。如果样品中存在专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌，那么，在25~28℃条件下，恒温培养5天的过程中，将会出现浑浊、沉淀，但是没有颜色变化（因为已高度稀释）。

需要注意的是，在培养初期，卡箍式取样瓶的瓶盖不能盖紧，以免产生过高压力，抑制可能存在的微生物的生长，甚至炸裂取样瓶。即使不炸裂，在打开取样瓶时也会引起样品四处飞溅，影响实验结果和操作过程。

检测啤酒生产过程中的二次污染

用NBB-B和无菌棉签配合，可检测啤酒生产过程中造成的二次污染。用无菌棉签擦拭样品，在25~28℃条件下培养3天，是否做厌氧处理均可，因为试管中的NBB-B有一定高度，能深层培养。若第一天NBB-B变黄，表明样品污染严重，啤酒有害菌已经适应了啤酒的环境，随时可能迅速蔓延；若第二天变黄，表明有危险的菌类在醋酸菌的菌囊中繁殖，菌囊形成了啤酒有害菌生长的理想环境；若第三天变黄，表明醋酸菌的黏稠液结块，清洗不够，仅为痕量污染。总之，若3天内变黄表明样品有问题，若3天后变黄则表明样品没有问题。这里只看颜色变化，没有必要做进一步镜检。

除此之外，鉴定擦拭样品的另一个重要依据是：观察是否形成浑浊，而鉴别四联球菌则必须制片镜检。

浓缩型液体培养基NBB-C

顾名思义，浓缩型NBB-C中含有更多两的放线菌酮，可以更好地抑制酵母生长。所以，NBB-C特别是用于未过滤浑浊啤酒的检测，也可用于较大量酵母样品的检测。当检测酵母样品时，在培养初期酵母仍能短期发酵，产生二氧化碳，形成厌氧环境，因此，可不必做厌氧培养，这一点同NBB-B检测酵母样品一样。

在NBB-C中，没有酸碱指示剂，不能指示颜色变化。而且，NBB-C只能在有啤酒成分的条件下使用，即只能和啤酒结合使用，否则，啤酒的选择性会丧失。

检测范围

NBB-C培养基检测范围也较广，能检测水、麦汁、酵母、浑浊啤酒、过滤后清酒以及成品啤酒等。下面分别加以叙述：

• 检测水和麦汁

将50ml样品（例如接种麦汁或最后冲洗水）放入180ml卡箍式取样瓶中，并加入约8ml NBB-C，然后用巴氏灭菌后啤酒灌满取样瓶，以增强选择性。在25~28℃条件下，恒温培养5天，不需要做厌氧培养。

• 检测较大量酵母

在180ml卡箍式取样瓶中或250ml三角瓶中，加入10ml酵母、4~8ml NBB-C、10~40ml无菌水和约60ml巴氏灭菌啤酒，在25~28℃条件下，恒温培养7天。由于此处酵母量较大，容易出现酵母样品中的某个微生物细胞不能接触到NBB-C和啤酒的情况，因此，最好采用摇床培养。摇床的转速一般为125r/min，由于震荡作用，酵母不能沉降，进而能与NBB-C、啤酒充分接触，这样，可使酵母中可能存在的痕量啤酒有害菌得到较好的营养，提高检出痕量污染的灵敏性，缩短检出污染的时间。同样，由于酵母的短期发酵，取样瓶中的样品可以不做厌氧处理。但是，在培养初期，取样瓶盖只能盖上而不能扣死。

• 检测浑浊啤酒

最常用的处理方法是取120~150ml浑浊啤酒，加入到180ml卡箍式取样瓶中，再加入3%~5%的NBB-C，最后用无菌水充满取样瓶。若浑浊啤酒量特别大（如1~2L），可以将上清液进行膜过滤，而将下面的酵母悬浊液和过滤膜一起放入卡箍式取样瓶中，再加入5%NBB-C，最后用无菌水充满取样瓶。

使用无菌水，不仅可以毫不费力地将取样瓶灌满，而且可以降低啤酒中酒花苦味物质对微生物的抑制作用，使潜在啤酒有害菌也能够生长出来。最重要的是，在相同的培养条件下（25~28℃、7天），不同的加水量对培养结果将有明显的影响。

1. 啤酒样品（约150ml），再添加3%~5%NBB-C，再用啤酒样品充满取样瓶，不添加水，可以检出专性啤酒有害菌。
2. 啤酒样品（约150ml），再添加3%~5%NBB-C，再用啤酒样品充满取样瓶，再添加10%无菌水，可以检出专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌。
3. 啤酒样品（约100ml）+3%~5%NBB-C，再添加20%无菌水，再用无菌水充满取样瓶，可以检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌以及间接啤酒有害菌。
4. 啤酒样品（约100ml）+3%~5%NBB-C，再添加20%无菌水，不充满取样瓶，可以检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌以及指示性微生物。

需要注意的是，用NBB-C检测含有酵母的样品时，在取样后应立即进行，否则，取样时摄入的氧气会使酵母立即生长（在瓶内产生压力），而且也会影响可能存在痕量污染检测结果。

由此可见，通过选择加水量，NBB-C不仅可检测出专性啤酒有害菌和潜在啤酒有害菌，还可检测出间接啤酒有害菌和指示性微生物。

在上述方案中，使用NBB-B培养基也能达到相类似的结果，即在过滤后的啤酒中加入10%NBB-B，在厌氧培养时，可检测出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌及间接啤酒有害菌；而在有氧培养时，可检出专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌和指示性微生物。

• 检测过滤后清酒、成品啤酒

在过滤后清酒、成品啤酒中，直接加入50%的NBB-C，然后按下述方法处理：

• 采用无菌水注满取样瓶，可以赶走瓶口的空气，使瓶内液体有一定深度，这样，瓶底部氧气含量将非常低，酒中又有一定量的二氧化碳，会自然构成厌氧环境。
• 直接做厌氧处理。在25~28℃条件下，恒温培养7天。

需要注意的是，虽然NBB-B和NBB-C都可用取样瓶培养，但是通常情况下，一般用NBB-B检测清酒、成品啤酒等不含有酵母的样品，而用NBB-C检测浑浊啤酒等含有酵母的样品。而且，二者的添加比例也不一样。例如，检测清酒、成品啤酒时需用5%~20%的NBB-B，以检测所有的啤酒有害菌、野生酵母和培养酵母；而检测浑浊啤酒等含有酵母的样品时，需添加大约5%的NBB-C，以抑制培养酵母的生长。

检测结果鉴定

由于NBB-C中不含酸碱指示剂，培养后不会有颜色变化，因而，也就不能依靠颜色是否改变来判断是否有啤酒有害菌。但是在NBB-C中啤酒有害菌生长十分迅速，很容易在显微镜下识别出来。

• 检测较大量的酵母、浑浊啤酒等浑浊样品

对于这类浑浊样品，其结果一般用下列两种办法进行鉴定：

1. 通过形成新的浑浊和沉淀鉴定

尽管这类样品是浑浊样品，但由于微生物生长时会形成新的浑浊和沉淀，所以浑浊和沉淀的数量必然会增加。正因如此，我们可以通过形成新的浑浊和沉淀来判断是否有啤酒有害菌存在，根据形成新的浑浊和沉淀的时间长短来判断污染的程度。若3天后形成新的浑浊和沉淀则表明是严重污染，6天后形成新的浑浊和沉淀则表明是痕量污染。

1. 通过镜检鉴定

虽然如上所述，可以通过形成新的浑浊和沉淀的时间来鉴定，但大多数情况下，仅通过浑浊、沉淀仍无法判断是否有微生物生长，必须取其浑浊、沉淀物进行涂片、镜检。

在酵母沉淀中，由于酵母自溶产物会引起pH值上升，这样就给啤酒有害菌提供了较好的营养物质和适宜的pH值，因此，啤酒有害菌很容易生长，特别是四联球菌，如果进行镜检，将很容易观察出来。

在600倍显微镜下，若每个视野中超过50个细菌，则被鉴定为有污染；若每个视野中只有1~5个细菌，则被鉴定为非啤酒有害菌。如果想进一步进行鉴定，可将沉淀培养于NBB-A上，同时，取一滴培养与NBB-B中。若在NBB-A上形成菌落，在NBB-B中形成浑浊，则该菌为潜在有害菌；若在NBB-A上形成菌落，在NBB-B中不形成浑浊，则该菌为啤酒无害菌或死亡细菌。

对于四联球菌来说，若每个视野超过100个细菌，则为严重污染；若每个视野小于20个，则为痕量污染。

• 检测水、麦汁、过滤后清酒以及成品啤酒等澄清液体

由于这类样品是清亮样品，所以可通过浑浊、沉淀来判断。当样品内有污染存在时，必然能观察到严重的浑浊或沉淀。若样品无浑浊或沉淀，可不必进行镜检，鉴定结果为无污染；若样品有浑浊和沉淀，则同上述“加大量酵母、浑浊啤酒等浑浊样品”一样进行鉴定。